克隆抗青霉素的抗體應用醫學雜志投稿征稿.docx

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克隆抗青霉素的抗體應用醫學雜志投稿征稿
[摘要]目的:制備抗青霉素的單克隆抗體(mAb)并建立雙抗體夾心ELISA檢測方法,對臨床上引起青霉素過敏反應的過敏原青霉噻唑蛋白進行爭論。方法:將半抗原青霉素和載體蛋白偶聯后免疫BALB/c小鼠,應用雜交瘤技術建立穩定分泌抗青霉素mAb的雜交瘤細胞株。常規制備腹水,用辛酸?硫酸銨法純化,并對純化的mAb進行特異性鑒定。通過對不同抗體組合的分析和條件的優化,建立檢測過敏原的雙抗體夾心ELISA方法。結果:經細胞融合、篩選及克隆化,共獲得9株穩定分泌抗青霉素mAb的雜交瘤細胞株,其中5株親和力較高。建立了雙抗體夾心ELISA相對定量檢測方法,該方法靈敏度達到870U/L,%,%,%,可用于A群鏈球菌制劑中青霉噻唑蛋白的檢測。結論:成功地制備了抗青霉素的mAb,并建立了相對定量檢測青霉噻唑蛋白的雙抗體夾心ELISA法。
[關鍵詞]青霉素,青霉噻唑基,單克隆抗體,雙抗體夾心ELISA,醫學雜志投稿征稿
青霉素因其高效、低毒的特點在臨床上被廣泛應用,但其結構中的內酰***環很不穩定,在溶液狀態尤其是堿性條件下易開環與蛋白、多肽的氨基發生親核反應生成穩定的青霉噻唑蛋白,形成臨床主要的過敏原。醫學雜志投稿征稿《中國病理生理雜志》是中國科學技術協會主管、中國病理生理學會主辦、暨南高校承辦的全國性綜合性病理生理學高級學術刊物。
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青霉素類抗生素的過敏反應發生率居各種藥物之首,。生理條件下青霉素開環后大約95%與蛋白質共價結合形成青霉噻唑基(benzylpenicilloyl,BPO)主要抗原準備簇,而其他一些共扼物如penicillanyl,penicillenate、青霉烯酸、penamaldate,penaldate,青霉***和penicoyl等則為次要抗原準備簇,后者僅占5%。理論上連接有兩個青霉噻唑基的蛋白、多肽就可能與IgE分子形成橋式結構從而引發I型超敏反應。青霉素的這種不穩定性使得在制備過程中添加有青霉素的生物制品以及(食品)中都可能殘留有青霉噻唑蛋白,而目前的檢測方法通常是針對游離的有抗菌活性的青霉素,尚無特地針對具有免疫原性且有潛在致敏危險的青霉噻唑蛋白的檢測方法。本爭論中,接受雜交瘤技術制備了穩定分泌抗青霉素mAb的雜交瘤細胞,并建立了相對定量檢測青霉噻唑蛋白的雙抗體夾心ELISA法,該方法特異性強、靈敏度高,有望對藥品、食品中可能殘留的青霉噻唑蛋白進行痕量檢測。
1材料和方法
,為本所制備,相對分子質量(Mr),%;牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OA)、多聚賴氨酸(Poly?L?Lysine,PLL)為Sigma公司產品;DMEM培育液為GibcoBRL公司產品,新生牛血清購自杭州四季清公司;HAT、HT、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、Ig亞類試劑盒均購自Sigma公司,PEG4000購自Fluke公司,BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Pierce公司,所用二抗均為Jakson公司產品,其余均為國產分析純試劑。Sp2/0細胞由本所細胞室供應,BALB/c雌鼠(6~8周齡)由本所試驗動物中心供應。
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①免疫原的制備:參照Haan的方法[5],,充分混勻后加入5mg牛血清白蛋白BSA(或卵清蛋白OA),調整pH值至11,37℃攪拌過夜,。將透析物分裝于-20℃保存。②篩選用包被抗原的制備:用直鏈結構的多聚賴氨酸(Poly?L?Lysine,PLL)與青霉素偶聯成BPO?PLL,方法同。
,每只20g,皮下多點及四腳掌初次免疫;14d后相同劑量腹腔加強免疫,每2周加強1次,加強后每隔7d眼眶采血,分別測定針對半抗原和載體蛋白的抗體效價,于細胞融合前3d尾靜脈加強免疫。
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、篩選及克隆依據常規法PEG融合[6]。分別用BPO?PLL、PLL作為包被抗原和對比抗原(均為1mg/L包被)、工作濃度兔抗鼠二抗,用間接ELISA檢測上清液。以免疫小鼠的血清為陽性對比,以Sp2/0細胞培育的上清液為空白對比,以細胞培育板中未長出克隆的細胞培育液上清為陰性對比,選取P/N值最高的接受有限稀釋法進行3或4次克隆。每次克隆后對擴大培育建庫的細胞上清再分別用陰性對比PLL、BSA、OA和檢測用抗原BPO?PLL、BPO?BSA、BPO?OA包被,間接ELISA檢測。
?硫酸銨法進行純化。經還原SDS?PAGE電泳檢測純度,BCA試劑盒測定純化抗體濃度。
:依據Sigma亞類測定試劑盒說明書測定。效價的檢測:接受間接ELISA法測定。相對親和力的比較:接受間接ELISA法,加入倍比稀釋的抗體與包被抗原反應30min,以mAb濃度對A450值作圖,依據反應曲線以達到50%最大結合的mAb的濃度來比較相對親和力。mAb特異性分析:用Westernblot檢測。分別將BSA、BPO?OA以合適濃度進行SDS?PAGE電泳,轉膜(15V恒壓,20min)后脫脂奶粉封閉過夜。加入合適濃度的純化抗體,室溫孵育1h,洗后加入工作濃度的堿磷酶標記的羊抗鼠二抗室溫孵育45min,充分洗滌后用NBT/BCIP顯色。計算各種抗生素的IC50并比較交叉反應率,計算公式:交叉反應率=(青霉素IC50/各種抗生素IC50)100%。
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(1)最佳抗體組合和工作濃度的確定:將親和力和效價均較高的5株抗體接受改良過碘酸鈉法標記HRP再兩兩配對,一株作為包被抗體,一株為酶標抗體,選用BSA偶聯青霉素的全抗原為標準抗原(以BSA含量計算,1ng/mL定義為1U/mL),選擇高濃度30U/mL、低濃度2U/mL作為檢測抗原篩選出最佳組合。方陣滴定確定包被抗體和酶標抗體的最適工作濃度。(2)標準曲線的繪制:,以100L/孔4℃包被16h,用5g/L酪蛋白封閉37℃1h,洗滌后加入等體積一系列不同濃度標準抗原(128U/mL開頭倍比稀釋)用于確定檢測范圍,37℃溫育90min后,洗滌加入以上確定濃度的酶標抗體100L/孔,37℃溫育1h后,洗滌加TMB底物顯色15min,終止反應后用酶標儀測定A450值。以抗原標準溶液濃度為橫坐標,其相應的A450為縱坐標,繪制標準曲線。(3)ELISA測定特異性、靈敏度、回收率及重復性:用建立的ELISA方法分別檢測制備的完全抗原及100倍濃度的BSA、OA;通過重復32次測定標準曲線的零濃度標準,以其均值加3個標準差為檢測的靈敏度,代入標準曲線計算?；厥章?在零濃度標準溶液中分別添加已知的標準抗原(高濃度30U/mL,中濃度12U/mL,低濃度3U/mL)再進行ELISA檢測并計算含量,依據公式:回收率=(測得值/真實值)100%。重復性試驗:選取高濃度32U/mL,中濃度16U/mL,低濃度4U/mL的共3份標準抗原溶液,每份標準溶液同批測定6次,每份標準溶液每天測定1次,連續測定6d,計算批內變異系數(CV)和批間變異系數(CV),評價方法的精密度。
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。該產品是一種在A群鏈球菌弱毒株中添加大量青霉素作穩定劑的抗腫瘤生物制品。將凍干制品進行適當稀釋后充分透析除去游離的青霉素再濃縮至合適的體積進行檢測,以未添加青霉素的A群鏈球菌全菌體作陰性對比,依據吸光度值和標準曲線對不同批次的產品中青霉噻唑蛋白含量進行比較。
2結果
?PAGE電泳顯示,連接上青霉素的載體蛋白Mr有明顯增加,條帶與載體蛋白相比彌散、脫尾;應用軟件分析Mr估算偶聯效率,分別將制備的完全抗原命名為BPO20?BSA、BPO6?OA。將完全抗原和載體蛋白分別包被,用本室保存的兔抗青霉素多抗、HRP標記羊抗兔二抗接受間接ELISA進行檢測,結果表明完全抗原制備成功。
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,可見小鼠產生了針對青霉素的抗體,經過幾次免疫后效價不斷上升。但由于載體蛋白的免疫原性很強,抗血清中針對載體蛋白的抗體占明顯優勢。試驗發覺,以OA作載體時,抗青霉素抗體的效價高于BSA作載體時的效價,并且抗OA抗體效價低于抗BSA抗體的效價,因此選用BPO6?OA免疫的小鼠進行融合。